上海泽叶生物科技有限公司
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核酸提取方法-磁珠法
人阅读 发布时间:2021-11-04 11:25
在基因组DNA核酸提取的实验中,重要的不仅仅是实验过程中的步骤,样本的前处理也同样很重要。
01、样本前处理-实验材料的保存:
血液样本:采用新鲜血液,如不能马上使用,需将新鲜血液裂红,得到的白细胞直接放入-70℃保存,避免反复冻融。
动物组织:选择新鲜、生长旺盛的组织,如不能马上进行提取,需放入-70℃或液氮冻存,避免反复冻融。
植物组织:选择新鲜、幼嫩组织,液氮或者-70℃保存,避免反复冻融。
细胞:选择处于生长旺盛时期的细胞,去掉培养基,-70℃或液氮保存
02、样本前处理-离散,均一,细胞集或细胞系
植物样本:采用液氮研磨或者在特殊裂解液中电动匀浆,防止样本中的多糖多分等被氧化。
动物样本:裂解液中手动/电动匀浆或液氮研磨
注:研磨时间不宜过长,尽量避免与空气接触,液氮量适当
血液样本:应用红细胞裂解液处理
细胞样本:胰酶处理或蛋白酶K处理
03、磁珠法原理
磁珠法中的细胞裂解液是一种蛋白变性剂,可使动植物的细胞裂解,并使与DNA结合的蛋白质变性,DNA游离释放,磁珠可以特异地吸附DNA,通过洗涤,去除DNA以外的蛋白质、多糖等杂质,再用洗脱液解离吸附在磁珠上的DNA,得到纯度和浓度均很高的DNA,可用于PCR模板、基因工程等。
04、磁珠法步骤
1、裂解
取抗凝全血到1.5mLEP管中,加入BufferA、BufferB,混合均匀。然后把EP管置于恒温水箱中温育15~20min。
2、结合
将EP管从温育设备中取出,离心后取上清,加入振荡混匀的磁珠结合液,颠倒混匀。将EP管置于磁力架上进行磁分离,弃废液(吸净管盖及管底残液)。
3、洗涤
⑴ 加入洗涤液Ⅰ,点振数次(若有团状或丝状物可增加点振次数及力度),然后磁分离,吸净管盖及管底的残液;
⑵ 加入洗涤液Ⅱ,点振数次(若有团状或丝状物可增加点振次数及力度),然后磁分离,吸净管盖及管底的残液;
⑶ 重复步骤⑵一次;
⑷ 室温下开盖干燥。
4、洗脱
加入洗脱液,放置水浴锅中温育后磁分离,小心吸取上清液至新的EP管中,进行下游实验。