在实验室里，看看师兄们做的PCR，扩增效果高，电泳条带完美，转头再看看自己的，唉，一言难尽，辛苦做半天，感觉一切都是那么正常，结果一测假阳性，此刻心情

不要伤心！不要难过！

之所以会出现这样的问题呢？

大概率还是出现在步骤上的细节问题。

所以呢？

要想实验成功呢，我们必须得打好基础，

一步一步的来，

知道它的原理、每一个操作步骤，

以及每个操作步骤都应该注意哪些地方，

这些都是对于我们实验非常重要的。

在本文中，我们将从PCR的简要历史，

原理、PCR的不同类型

去跟大家一起学习！！

聚合酶链反应（PCR）

聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制。是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。

PCR简要历史

1983年，美国生物化学家Kary Mullis深夜驾车回家时，灵感一闪而逝。这个想法很简单：在实验室的试管中复制发生在细胞中DNA的复制过程。而这个过程的结果是相同的：在现有的基础上生成新的互补DNA（cDNA）链。经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。

PCR技术雏形

1971年，Khorana第一个成功完成基因的合成—丙氨酸tRNA编码基因[2]; Kleppe提出体外扩增设想[3]。但由于当时的技术水平有限，并且具有较强稳定性的DNA聚合酶还未被发现，DNA体外扩增技术并未获得全面推广。

PCR技术首次提出

1985年，Mullis阐述了具有划时代意义的PCR技术。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中提供体外合成合适的条件---模版DNA，寡核苷酸引物，dNTP，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。最初使用的大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。

PCR技术优化

1988年，Saiki等在黄石公园温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus,Taq)中提取到—种耐高温DNA聚合酶。该酶耐高温的性质使其热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶,从而极大地提高了PCR扩增的效率。Taq酶的发现，使得PCR真正变为现实，为其自动化铺平了道路。

PCR技术爆炸年

1989年，美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首，将稳定DNA聚合酶命名为“年度分子”。

诺贝尔奖

凯利·穆利斯（Kary Banks Mullis）博士因PCR技术荣获诺贝尔化学奖

标准PCR实验

PCR用于从称为模板DNA的起始材料的复杂混合物中扩增特定的DNA片段。样品制备和纯化方案取决于起始材料，包括样品基质和靶DNA的可及性。通常，需要最少的DNA纯化。但是，PCR是需要了解要扩增DNA片段（称为靶DNA）两侧的DNA序列信息。

通常，PCR反应需要五种关键试剂：

1. 缓冲液

标准的缓冲液含 1pmol/ml Tris ·HCl，其 pH 为 8.3-9.0（室温），而在延伸温度（72 ℃）下，pH 值接近 7.2 。缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，一般使用  Mg2+。

2.dNTP

脱氧核糖核苷三磷酸的缩写，是包括 dATP,  dGTP,  dTTP,  dCTP 等在内的统称，即合成新的 DNA 链的材料。4 种 dNTP 的浓度相等，总浓度一般为 200pmol/ml （即饱和浓度）。dNTP 可与  Mg2+ 结合，使游离的  Mg2+ 浓度下降，影响 DNA 聚合酶的活性。

3. 引物

引物是一段短的单链 DNA 片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，DNA 聚合酶可由其 3′端开始合成新的核酸链。引物长度一般以 18～30bp 为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。

4. 模板

模板是一段单链或者双链 DNA，提供用于进行 PCR 扩增的原始信息。对模板的纯度要求低，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA 聚合酶抑制剂、DNA 结合蛋白等。模板 DNA 应该尽量保持低温保存。

5.Taq DNA 聚合酶

Taq DNA 聚合酶以 DNA 为复制模板，从将 DNA 由 5' 端点开始复制到 3' 端的酶。DNA 聚合酶的主要活性是催化 DNA 的合成（在具备模板、引物、dNTP 等的情况下）及其相辅的活性。必须一直保存于－20℃，内含甘油保存。最适反应温度 72 ℃，即延伸温度。通常在配制 PCR 体系的最后加入。

PCR反应示意图

 

上图是PCR反应的示意图，步骤为：变性、退火和延伸。接下来让我们仔细了解和学习每个步骤。

1、变性：PCR的第一步称为变性，将模板DNA加热到95°C几秒钟，将两条DNA链分开，使它们之间的氢键迅速断裂。

2、退火：然后将反应混合物冷却30秒至1分钟。退火温度通常为50-65°C，但是确切的最佳温度取决于引物的长度和顺序。必须对每套新的引物进行仔细的优化。

两条DNA链可以在此温度下重新连接，但是大多数不会，因为该混合物包含大量过量的引物，这些引物在特定的互补位置与模板DNA结合或退火。退火步骤完成后，模板DNA和引物之间将形成氢键。此时，聚合酶已准备好延伸DNA序列。

3、扩展：然后将温度升至混合物中存在的DNA聚合酶的理想工作温度，通常约为72°C，对于Taq而言约为74°C。

PCR的不同种类

1、反转录PCR（reverse transcription，RT-PCR）：经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段。一般与QPCR联用。可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。

2、实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，QPCR）：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。常用的QPCR方法有荧光染料法（SYBR Green I）和探针法（TaqMan）。qPCR的应用非常广泛，在临床疾病诊断、疾病检测、食品安全、科学研究等领域都有广泛的应用。

3、反向PCR（InversePCR, IPCR）：又称为染色体缓移或染色体步移。是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段。主要应用于病毒、细菌等研究、基因分型。

4 多重PCR（multiplex PCR）：又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定某些病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型鉴定。

5 巢氏PCR （Nested PCR）：巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对或多对PCR引物扩增完整的DNA片段，从而保证PCR扩增的高度特异性。主要用于极少量DNA模板的扩增。在RACE中，也利用巢式PCR增加特异性。

 

6 不对称PCR（asymmetric PCR)：利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA (ssDNA)的方法。在扩增循环中引入不同的引物浓度（常用1：50-1：100）。在最初的几个循环中主要产物还是双链DNA, 但当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。不对称PCR主要为测序制备ssDNA，也是研究真核DNA外显子的好方法。

7 锚定PCR(Anchored PCR)：用酶法在一通用引物反转录cDNA 3’-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。类似RACE。它可用于扩增未知或全知序列, 如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。

8 等位基因特异性PCR(Allele specificPCR,ASPCR)：是指利用引物与模板之间的碱基错配可以有效地抑制PCR反应，进而达到模板区分（等位基因区分）的目的。适合用于基因分型。

9 原位PCR（in situ PCR）：原位PCR是一种通过在单细胞或组织切片上对特异的核酸序列进行原位扩增、检测定位的新技术。结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。用于外源性基因片段检测、、观察病原体在体内分布规律、内源性基因片段检测、导入基因检测、遗传病基因检测等等。

10 重组PCR（recombinant PCR）：又叫重叠延伸PCR、overlap PCR。是指把两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR法。其基本原理是两个基因片段设计在引物中，先分段对模板扩增，除去多余的引物后，将产物混合，再用一对引物对其进行PCR扩增。所得到的产物是一重组合的DNA。

 

11 递减PCR（touch down PCR）：又称降落PCR。随着循环数的增加，逐步降低退火温度的PCR方式。用来避免非特异性序列的扩增。递减PCR还可与简并引物结合使用，用来推出一段已知肽链的氨基酸序列所对应的DNA碱基序列。

12 热启动PCR（hot start PCR）：是指使Taq DNA 聚合酶只有在样品温度至少超过70℃时才发挥作用的PCR。目前有很多商品化的热启动酶，比如NEB的Q5热启动酶。热启动酶的出现大大提高了PCR扩增的特异性。在点突变、基因工程、基因改造等方面表现尤为突出。

13 长片段PCR(long-PCR)技术：顾名思义就是进行长片段扩增的技术。此技术主要用于基因组扩增。从几kb到几十kb。此技术对于模板、酶、引物等各方面要求很高。近年来出现许多商品化的长片段扩增酶。

PCR的应用场景如今,PCR已经成为一种独立技术和其他方法中的主力军，已经改变了一系列的学科。其中包括了：

遗传研究 ：PCR已在全球大多数实验室中使用。最常见的应用之一是基因转录分析，旨在评估特定基因转录本的存在或丰度。它是通过克隆操作生物（动物，植物和微生物）遗传序列的有力技术。这使基因或基因的一部分能够被插入，删除或突变，以通过遗传标记工程化改变表型，阐明基因功能并开发仅举几例的疫苗。

医学和生物医学研究：PCR被用于许多医疗应用，从与疾病相关的基因突变的诊断测试到传染原的鉴定。在医学领域使用PCR的另一个很好的例子是产前基因检测。

法医科学 ：我们独特的遗传指纹意味着PCR可以在亲子鉴定和法医调查中发挥作用查明样品的来源。

环境微生物学和食品安全：通过PCR检测病原体，不仅在患者样品中，而且在食品或水等基质中，对于诊断和预防传染病都至关重要。