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Akt2与HBV DNA水平相关性及其机制研究｛泽叶生物文献｝
人阅读 发布时间：2018-07-02 18:44
Akt2与HBV DNA水平相关性及其机制研究
本实验的主要目的是研究慢性乙肝病毒性肝炎患者Akt2基因与乙肝病毒载量的关系;探究HBV DNA对Akt2表达的影响;构建并评价慢病毒介导的RNA干扰在人Hep G2.2.15中的基因沉默效应及沉默后乙肝患者中HBV DNA表达情况。方法:收集240例乙肝患者及80名健康人的外周血,利用荧光定量PCR检测乙肝患者血中HBV的病毒载量,将实验对象分为三组,根据HBV DNA病毒载量的高低:将患者分组,HBV DNA>1×107拷贝/ml定为高病毒载量组、1×105拷贝/ml≤HBV DNA≤1×107拷贝/ml定为中病毒载量组,HBV DNA<1×105拷贝/ml定于低病毒载量组。ELISA法检测4组外周血的Akt2的含量;比较四组中Akt2的表达差异;培养Hep G2及Hep G2.2.15细胞,并提取两类细胞中的RNA,并逆转录成c DNA,采用实时荧光定量PCR法(RT-PCR)检测两类细胞中Akt2 m RNA的表达水平;设计Akt2的RNAi寡聚核苷酸序列;慢病毒载体构建Akt2的sh RNA载体,转染入大肠杆菌并观察重组表达状况;得到重组腺病毒需要利用293T细胞包装;绿色荧光蛋白(GFP)作为标记,逐孔稀释法确定转染效率及滴度;以实时荧光定量法比较各组对Akt2m RNA的干扰效果。最后采用ELISA法检测实验组与对照组Hep G2.2.15细胞上清液中Akt2的表达水平。结果:80例健康人血清Akt2的含量为292±15ng/ml;低病毒载量组的80例患者其血清Akt2的含量为378±21ng/ml;中病毒载量组的80例患者血清Akt2的含量为537±18ng/ml,而高病毒载量组的80例患者血清中Akt2含量为622±12ng/ml。CHB患者的不同病毒载量组间及与健康对照组对比,其差异均有统计学意义(P1,2,3<0.001);Hep G2.2.15细胞中Akt2 m RNA的表达水平较Hep G2高,差异有统计学意义(P<0.05);筛选了所构建的3个Akt2靶向序列,包装sh RNA慢病毒后转染Hep G2.2.15细胞并检测慢病毒转染后的沉默效率(效率达到85%),比较得出沉默效率最高的靶序列和工作条件。在细胞培养上清液中,实验组的Hep G2.2.15细胞上清液HBV DNA病毒载量为3.63×106拷贝/ml,而对照组中上清液HBV DNA病毒载量为5.17×106拷贝/ml。两组的差异有统计学意义,P<0.05。结论:慢性乙型肝炎患者血清Akt2的含量与HBV DNA载量密切相关;HBV能够在m RNA和蛋白水平上调肝癌细胞Akt2的表达;Akt2的表达量降低细胞中HBV DNA的分泌量减少。在临床水平和细胞`水平证实Akt2与乙型肝炎病毒复制密切相关。
本实验的主要目的是研究慢性乙肝病毒性肝炎患者Akt2基因与乙肝病毒载量的关系;探究HBV DNA对Akt2表达的影响;构建并评价慢病毒介导的RNA干扰在人Hep G2.2.15中的基因沉默效应及沉默后乙肝患者中HBV DNA表达情况。方法:收集240例乙肝患者及80名健康人的外周血,利用荧光定量PCR检测乙肝患者血中HBV的病毒载量,将实验对象分为三组,根据HBV DNA病毒载量的高低:将患者分组,HBV DNA>1×107拷贝/ml定为高病毒载量组、1×105拷贝/ml≤HBV DNA≤1×107拷贝/ml定为中病毒载量组,HBV DNA<1×105拷贝/ml定于低病毒载量组。ELISA法检测4组外周血的Akt2的含量;比较四组中Akt2的表达差异;培养Hep G2及Hep G2.2.15细胞,并提取两类细胞中的RNA,并逆转录成c DNA,采用实时荧光定量PCR法(RT-PCR)检测两类细胞中Akt2 m RNA的表达水平;设计Akt2的RNAi寡聚核苷酸序列;慢病毒载体构建Akt2的sh RNA载体,转染入大肠杆菌并观察重组表达状况;得到重组腺病毒需要利用293T细胞包装;绿色荧光蛋白(GFP)作为标记,逐孔稀释法确定转染效率及滴度;以实时荧光定量法比较各组对Akt2m RNA的干扰效果。最后采用ELISA法检测实验组与对照组Hep G2.2.15细胞上清液中Akt2的表达水平。结果:80例健康人血清Akt2的含量为292±15ng/ml;低病毒载量组的80例患者其血清Akt2的含量为378±21ng/ml;中病毒载量组的80例患者血清Akt2的含量为537±18ng/ml,而高病毒载量组的80例患者血清中Akt2含量为622±12ng/ml。CHB患者的不同病毒载量组间及与健康对照组对比,其差异均有统计学意义(P1,2,3<0.001);Hep G2.2.15细胞中Akt2 m RNA的表达水平较Hep G2高,差异有统计学意义(P<0.05);筛选了所构建的3个Akt2靶向序列,包装sh RNA慢病毒后转染Hep G2.2.15细胞并检测慢病毒转染后的沉默效率(效率达到85%),比较得出沉默效率最高的靶序列和工作条件。在细胞培养上清液中,实验组的Hep G2.2.15细胞上清液HBV DNA病毒载量为3.63×106拷贝/ml,而对照组中上清液HBV DNA病毒载量为5.17×106拷贝/ml。两组的差异有统计学意义,P<0.05。结论:慢性乙型肝炎患者血清Akt2的含量与HBV DNA载量密切相关;HBV能够在m RNA和蛋白水平上调肝癌细胞Akt2的表达;Akt2的表达量降低细胞中HBV DNA的分泌量减少。在临床水平和细胞`水平证实Akt2与乙型肝炎病毒复制密切相关。
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