分离肿瘤干细胞的主要思路与分离成体干细胞的思路类似，包括根据特殊的表面标记分子进行分选和 SP 细胞分离，其中依赖干细胞表面标志分离的可供选择的分选系统为免疫磁珠分选系统和荧光激活细胞分选技术（fluorescence-activated cell sorting，FACS）。

   

原理

  免疫磁珠分选法分离纯化肿瘤干细胞的原理是利用细胞特有的表面标志，然后将抗体包被磁珠，制成免疫磁珠，再将细胞悬液与磁珠共孵育，由于其表面标志与磁珠上特异的抗体结合从而将被吸附在磁珠上，其他细胞则不被吸附，由此可分离出肿瘤干细胞。   
 

材料与仪器

  

器材：

• 磁性细胞分选器（MACS）或全自动磁性细胞分选仪（AutoMACS）

• 超净台

• 一次性无菌移液管

• 15 ml 和 50 ml 离心管

 

试剂：

• 材料：抗人 AC133 磁珠及 MS 分离柱

• MACS 缓冲液

• TC199 培养基

• 青霉素

• 链霉素

• PBS

• EDTA-Na2

   

步骤

  

免疫磁珠分选法的基本过程可分为如下几步（以分离纯化 AC133＋脑肿瘤干细胞为例）：

 

（一）试剂配制

 （1）组织保存液的配制 TC199 培养基，100 ml；青霉素（10000 U/ml），4 ml；链霉素 (10000 μg/ml),4 ml 用 0.22 μm 滤器过滤除菌。4 ℃ 保存。 
（2）MACS 缓冲液的配制 PBS，200 ml；牛血清白蛋白，1 g；EDTA-Na2，0.159 g。调节 pH 值至 7.2，用 0.22 μm 滤器过滤除菌。4 ℃ 保存。 

（二）开始前准备

 脑肿瘤手术样本，取材后在保存液中 4 ℃ 保存，尽快进行下一步实验。

 

（三）磁珠标记

（1）按实体肿瘤细胞培养章节中的方法制备出脑肿瘤的单细胞悬液。 
（2）300 g 离心 6 min。 
（3）磁性标记细胞。去除上清液，拍散沉淀的细胞团，用预冷的缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度为 1x107 个／80 μl 缓冲液（少于 1x107 个细胞时也用 80 μl 缓冲液重悬），每 80 μl 细胞悬液中加入 20 μl 抗人 AC133 磁珠。注意：标记过程要快速，保持冰上操作，以防止抗体非特异性结合。 
（4）轻轻混匀，4 ℃ 孵育 20 min。 
（5）加入 10 倍或 20 倍标记容积的缓冲液，300 g 离心 10 min。 
（6）完全去除上清液。每 108 个细胞用 500 μl 缓冲液重悬。 

（四）磁珠分离

（1）将无菌分离柱从包装中取出，固定在 MACS 磁场内。注意分离柱的无菌。
（2）分离柱下放一收集管。
（3）先用 500 μl 无气泡的缓冲液润洗分离柱，使其流过分离柱，但勿使其干燥，去除流出物，更换收集管，准备分离。 
（4）缓慢将标记的细胞悬液加入分离柱，收集流出物，作为阴性部分。 
（5）待细胞悬液全部进入分离柱后，立即加入缓冲液冲洗。每次用 0.5 ml 缓冲液洗涤分离柱，共三次。注意：每次加缓冲液的时机必须是前面的液体刚全部进入分离柱，但柱子尚未干燥前。 
（6）待液体流尽后，将分离柱移出磁场，加入 1 ml 缓冲液于分离柱内，加压洗脱，收集洗脱的阳性细胞。 

（7）细胞纯度的检测：用 FITC 标记的 AC133 抗体标记细胞，4 ℃ 孵育 30 min，离心洗涤两次，用 0.5 ml 生理盐水重悬，上机检测。细胞纯度可达 95％～99％。
（8）对分离获得的脑肿瘤干细胞进行生物学鉴定。 

（五）实验结果及分析

（1）用 FITC 标记的抗 AC133 抗体对分选得到的细胞进行标记，流式细胞鉴定阳性比例。 
（2）对分离获得的脑肿瘤干细胞进行生物学鉴定，以明确其是否具有普通肿瘤细胞所不具备的干细胞特征，即自我更新和分化能力。 

① 一般生物学特征鉴定。主要观察肿瘤干细胞的形态，生长特征及核型分析。肿瘤干细胞的形态多为圆形，大小不一。与普通肿瘤细胞相比，肿瘤干细胞具有倍增时间较短、细胞生长密度增加、细胞核分裂指数较高，并且具有无限增殖能力、细胞侵袭能力较强等特征。细胞周期分析，大部分肿瘤干细胞处于 Go 期。 
 

② 体外克隆形成能力或肿瘤球形成能力鉴定。这是肿瘤干细鉴定的一个重要指标。

a. 克隆形成实验：在克隆形成实验中，将分选的阴性及阳性细胞分别以低浓度移植到 96 孔培养板，每孔植入 100～200 个细胞，大约 7 d 后观察其各自克隆形成情况，由此证明分选的细胞形成克隆的能力。b. 集落形成实验：白血病干细胞可进行集落形成实验，将分离的阴性及阳性细胞分别接种到合适的集落培养基中进行培养，一般 14 d 后观察集落（> 20 个细胞）形成数量。与普通组细胞所形成的集落相比，白血病干细胞能够形成小的分散的集落，并且很少发生红系细胞分化。

c. 实体瘤干细胞的肿瘤球形成实验：实体瘤干细胞在体外培养时常常形成肿瘤球。将分离得到的肿瘤干细胞重悬于合适的培养基中，进行倍比稀释，并接种到 96 孔培养板，最终细胞稀释的范围从 200～1 个细胞/孔。培养 7 d 后，对总的肿瘤球形成数目进行计算，并计算比例。与分离的阴性细胞相比，肿瘤干细胞形成肿瘤球能力更强，得到肿瘤球的比例也越高。
 

③ 分化能力鉴定。肿瘤干细胞的一个重要特征就是具有分化能力。a. 体外分化能力的鉴定：可对分离的肿瘤干细胞和在合适培养基中继续培养一段时间后的肿瘤细胞进行干细胞相关和分化相关的分子检测。可采用免疫组化，流式细胞仪分析以及 RT-PCR 的手段进行研究。

b. 体内移植实验：体内实验是对肿瘤干细胞自我更新与增殖分化能力的直接验证。将肿瘤干细胞注射到严重免疫缺陷的实验小鼠体内（例如一次性注射 100 个、200 个、500 个、1000 个细胞）观察其体内成瘤的情况和免疫组织化学检测，由此推断目的细胞形成肿瘤组织和增殖分化出不同成熟细胞的能力。肿瘤干细胞移植到 NOD/SCID 鼠内，可以在受体鼠内连续传代，分离出的肿瘤干细胞二次移植时仍能产生具有异质性癌细胞的肿瘤，并可多次重复，得到的肿瘤与原代肿瘤一致。

 

④ 肿瘤干细胞相关分子表达的检测。肿瘤干细胞和成体干细胞之间有很多的相关性，肿瘤干细胞也能检测到与干细胞自我更新和分化相关的基因表达。已经有报道脑肿瘤干细胞除了表达 CD133，还具有 Sox-2、musashi-1、Bmi-1、巢蛋白（nestin）、melk、PSP、磷酸丝氨酸磷酸化酶等神经干细胞和其他干细胞的基因特征。

   

注意事项

  

1.免疫磁珠细胞分选具有快速、纯度好、产量高、对细胞活力损伤小等优点。

2.磁珠标记策略有直接标记和间接标记。间接磁性细胞标记时，选择未结合抗体、生物素化抗体或者荧光素标记抗体作为一抗标记细胞，再使用抗免疫球蛋白微珠、抗生物素或链亲和素微珠、抗荧光素微珠作为二抗磁性标记细胞。间接标记主要适用于没有直标磁珠时，或实验需要用几种抗体的混合物同时分选或去除多种类型的细胞，或使用自备抗体或者配体的磁珠分选，此外间接标记有放大作用，因此可在磁性分选抗原表达弱的目的细胞时使用。3.磁珠分选策略分为阳性分选和阴性分选。阳性分选策略是用免疫磁珠直接从细胞混合物中分离靶细胞的方法，适用于分选标志明确的肿瘤干细胞。阴性分选策略是用免疫磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以纯化的方法，适用于缺乏针对目的细胞的特异性抗体，把已知的成熟细胞组分去除后，达到富集肿瘤干细胞的目的。在分选阳性比例很低的肿瘤干细胞时，还经常联合使用阳性分选和阴性分选，以得到高纯度的肿瘤干细胞。