为什么，别人的ELISA做的那么好看，而我却在苦苦思索：

ELISA实验要想做的好

细节少不了

细节有了，那实验数据这块不得拿捏的死死的。

小编总结了一些干货技巧，

有了这些

你就成为了下一个实验大佬

ELISA方法被广泛应用于各种抗原抗体的测定。但是测定中的影响因素比较，而且在操作中也有要有技术要求，在检测过程中，也难免会出现一些问题，导致错误结果，出现之后，我们也不必着急，小编为你们准备了以下几个可能会引起错误结果的因素：

一、标本因素

二、试剂因素

三、操作因素

四、仪器因素

 标本因素 

标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致，分为内源性物质和外源性物质两种。

内源性物质	外源性物质
类风湿因子	标本溶血
补体	标本污染
嗜异性抗体	贮存过久
自身抗体	凝集不全
医源性诱导的抗体	采血管中添加物
交叉反应物

有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物，可以不同程度影响检测结果，

1.类风湿因子

人血清中IgC、IgM型风湿因子（RF）可以与ELISA系统中的捕捉抗体及酶标记二抗的FC段直接结合，导致假阳性，

2.补体

ELISA系统中固相一抗和二抗过程中，抗体分子发生变构，其FC段的补体C1q分子结合位点被暴露出来，使C1q可以将二者链接起来，从而造成假阳性。

3.嗜异性抗体

人类血清中含有能与啮齿类动物（如鼠等）Ig（s）结合的天然嗜异性抗体，可将ELISA系统中一抗和二抗连接起来，可能造成假阳性。

4.嗜靶抗原的自身抗体

抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体，有时能与靶抗原结合形成复合物，再ELISA方法中均可干扰抗原抗体测定结果，

5.医源性诱导的抗鼠Ig（s）抗体

鼠源性CD3等单克隆抗体治疗，用放射性同位素标记鼠源性抗体的影像诊断及靶向治疗等新技术，均有可能是病人体内产生抗鼠抗体，另外，被鼠等啮齿类动物咬伤的病人体内也可以产生抗鼠Ig（s）抗体，这些病人ELISA测定是均可产生假阳性。

6.交叉反应物质

类地高行、类AFP样物质等，是与靶向抗原有交叉反应的物质，再用多抗测定抗原是对测定结果影响不大，但在用单克隆抗体测定抗原时，假如交叉抗原决定簇正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时，也会出现假阳性结果。

外源性物质：

1.标本溶血

红细胞溶解释放的血红蛋白具有过氧化物酶活性，在以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中，会导致非特异性显色，故标本采集时应避免溶血

2.标本受细菌污染

菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，同溶血标本一样，可产生非特异性显色而干扰测定结果，

3.标本保存不当

标本放置时间过长，会使抗原或抗体免疫性减弱，可出现假阴性，

4.标本凝集不全

再没有促凝集可抗凝剂的情况下，正常血液采集后1.5~2h开始凝固，18~24h完全凝固，临床检验工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，此时的血清中仍残留部分纤维蛋白原，再ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；这类情况于次日复查时血凝已完全，血清中不再有纤维蛋白原存在，故复查结果变为阴性，为避免上述干扰作用，血液标本采集后最好使其充分凝固在分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。

5.标本管中添加物的影响

抗凝剂（如肝素，EDTA）、酶抑制剂（如NaN3可抑制ELISA系统中辣过氧化物酶活性）及分离胶等均对ELISA测定有一定干扰作用。

 试剂因素 

1. 试剂应选择灵敏度高，稳定性强，批间差小，操作方便的试剂盒

2. 不同厂家的试剂不能混用，

3. 注意试剂的批号和出厂日期

  4.避免买到假的试剂盒

 操作因素 

1. 加样

   对于间接ELISA标本一般都要进行稀释，如果加样不准就会造成误差，尤其当稀释倍数大时，很小的误差，会导致较大的相对误差，使阴性（或弱阳性）标本呈阳性（或阴性）。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。目前，大部分血站都已使用全自动酶免加样系统处理标本，可较好地避免以上误差。

2. 洗涤

   在ELISA中正确的洗涤是保证得到可重复结果的关键一步，应引起操作者重视。无论是手工操作还是机器操作，得出不正确的结果常与不正确的洗涤有关，ELISA就是靠洗涤来达到分离游离和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以消除残留在板孔中没能与固体抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。

3. 温育

   每种试剂都有其最合适的反应模式，其中温度和温育时间控制是重要因素。因孵育温度高，反应时间长，会造成整板本底高，阳性率高。温育一般用湿盒或水浴，反应板不宜叠放，以保证各板温度都能迅速平衡，为避免蒸发，板上应加盖。

 仪器因素 

1. 酶标仪是垂直对反应孔比色，反应孔底部污染时，出现反应孔吸光度值偏高。检验医学网

2. 洗板拖尾现象，洗板机在洗板过程中，出水针出水不畅，滴滴答答不间断出现水滴，造成板上水过多，拍板不干净。

    

ELISA技巧

1. 室温：确保所有试剂在使用前均平衡至室温（除非另有说明）

2. 防潮：如果有剩余检测孔，则将剩余的孔板密封保存，以防止有效成分降解；

3. 分装：对于非一次性使用的标准品，将剩余标准品等分至较小体积并冷冻保存，以防止反复冻融；

4. 使用多道移液器：多道移液器可以加快标准品和样品的铺板速度，并得到更一致的结果；

5. 加样角度：加样时，将移液器枪头保持一定角度，不要接触微孔底部；

6. 更换移液器枪头：建议您在不同样品或标准品之间更换移液器枪头，以防止污染；

7. 使用洗板机：建议使用洗板机，因为使用多道移液器手动洗板可能导致更高的背景；

8. 增加浸润时间：在手动或用洗板机清洗微孔板时，在两次洗板步骤之间增加 30 秒的浸润时间，便于洗涤缓冲液发挥功效；

9. 孵育时间：密切关注孵育时间，每小时孵育时间的误差应控制在 5 min 内；

10. 多板操作，切勿叠放：如果您正在进行多板操作，请勿在孵育期间将微孔板堆叠在一起，而应单独放置在平坦表面上。