前几期我们讲到了，PCR技术、逆转录PCR技术以及qPCR技术，这期我们就来讲讲核酸提取的相关知识，核酸提取作为分子实验中最基础的实验之一，几乎是所有实验的基本，无论后续的克隆、PCR、qPCR、建库测序等等都需要核酸才能顺利进行。今天我们就来简单了解核酸提取的基本原理和方法。

什么是核酸

核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一，分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），其中RNA又可以根据功能的不同分为核糖体RNA(r RNA)，信使RNA（m RNA）和转移RNA（t RNA）。
核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物内、生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。
DNA主要集中在细胞核内，线粒体和叶绿体中，而RNA主要分布在细胞质当中 

 

图一：核酸模型图

 核酸提取类型  总RNA提取

总RNA中，75-85%为rRNA(主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA)，其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA、miRNA、siRNA、小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）及核仁小分子RNA（small nuceolar RNA，snoRNA）等组成。

miRNA提取

MicroRNAs (miRNAs)是小型的、高度保守的RNA分子，如小干扰RNAs (siRNAs)，通过与他们的碱基配对调节其同源mRNA的分子表达，以预防通过各种机制的表达。他们已成为进行发育、细胞增殖、分化和细胞周期的重点监管机构。

基因组DNA提取

进行基因结构和功能研究以及基因诊断，通常要求得到的片段长度不小于100～200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。

质粒抽提

质粒抽提方法即去除RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。

 核酸提取的目的  核酸提取的目标

• 纯化后的核酸样品中不应该存在对后续实验有影响的有机溶剂和过高浓度的重金属离子；

• 其它生物大分子物质如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度

DNA提取的目的

• PCR(polymerase chain reaction)

• RFLP(限制性片段长度多态性)

• Southern印迹法

RNA提取的目的

• RT-PCR(反转录PCR)

• 蛋白质水平分析（mRNA）

• Northern印迹法

 核酸提取纯化原则和要求  01

保证核酸一级结构的完整性；

02

排除其它分子的污染（如提取DNA时排除RNA的干扰）；

03

核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；

04

其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度；

05

排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，反之亦然。

 核酸提取的方法 酚抽提法

本分作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的降解作用，用本分处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与本分相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用 乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃慢慢绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。

碱裂解法

载体是目的基因克隆和表达不可或缺的工具，典型的载体如质粒载体，将目的基因与质粒载体链接，获得重组质粒DNA再转染到细菌体内复制。早在1979 年，研究者成功用碱性裂解液快速提取筛选重组质粒DNA。该方法基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离质粒DNA的目的。细菌悬浮液在pH12.6 的碱性溶液十二烷基硫酸钠（SDS）中，会使细胞壁破裂，蛋白质和染色体DNA 变性，质粒DNA 的大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链在拓扑学上是相互缠绕的，彼此不会分离。当pH 恢复到中性时，变性的质粒DNA 分子迅速复性，呈溶解状态，而蛋白质与染色体DNA 不能复性而呈絮状沉淀。通过离心处理可除去染色体DNA 与不稳定的大分子RNA 以及蛋白质-SDS 复合物等，而质粒DNA 保存在溶液中，从而达到分离质粒的目的。

CTAB裂解法

1980年，科学家们使用溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）法可快速提取高纯度的大分子量植物DNA。植物和某些革兰氏阴性菌含有大量多糖成分，基因组提取，CTAB 是一种非离子型去垢剂，它能使核酸和酸性的多糖从低离子强度的溶液中沉淀出来。同时，蛋白质和中性多糖等杂质留在溶液中。后来科学家们采用SDS-CTAB结合法，利用高浓度盐离子和SDS 除去蛋白和多糖，然后用低浓度盐离子和CTAB 进一步纯化DNA。CTAB 裂解法对产生大量多糖的生物体如植物和某些革兰氏阴性菌的核酸提纯非常有用。

 柱层析法

 前面我们提到的几种核酸的分离纯化都是通过液相介质进行，而柱层析法（包括磁珠）都是基于固相分离技术而产生的。不仅使分离上更加方便、快捷, 固相技术的运用还拓宽了待测物范围,并在检测灵敏度、重现性等方面得到了改善。以离心柱法提DNA为例，首先加入相应的裂解液裂解各种类型的样本细胞；其次用特别的 pH 缓冲液调节柱子pH 改变其表面或官能团，使其成为特殊的化学形式以吸附核酸；再次，用洗涤缓冲液洗涤以除去蛋白质等杂质；最后，用 TE缓冲液或水洗脱柱子上的目的核酸，收集纯化的核酸。柱子中的滤膜通常采用硅基材质，比如玻璃微纤维，二氧化硅粒子等。这里的硅基材质能吸附核酸，主要是缓冲液中阳离子发挥的桥梁作用，Na+能吸附核酸磷酸盐骨架上带负电荷的氧，在高盐酸性条件下，Na+ 打破水中的氢和二氧化硅上带负电荷的氧离子间的氢键，使得二氧化硅与DNA紧密结合，而在低离子强度下，DNA将会从硅基膜被竞争性洗脱下来。

 磁珠法

一般用于自动化提取，生物磁珠是一种新型的功能化固体载体，其表面包被有活性基团，可以与多种生物活性物质发生偶联，兼具有液体的流动性和固体磁性材料等特点，在外磁场的作用下可以定向移动和栠中，当撤去外磁场后，稍加振荡或抽吸又可均匀分散于液体中，从而使固液相的分离变的十分快捷方便，通过简单的洗脱可以得到纯度很高的靶向物质。

下面是各种核酸提取方法的对比，大家可以根据需要选择合适的核酸提取方法：