逆转录PCR（reverse transcription PCR）或者称反转录PCR（reverse transcription-PCR, RT-PCR），是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。它是一种以 RNA 为样本，RNA链被逆转录成为互补DNA（cDNA），再以此为模板通过 PCR 进行 DNA 扩增。

 RT-PCR可用于场景

1. 分析基因的转录产物；

2. 获取目的基因；

3. 合成cDNA探针；

4. 构建RNA高效转录系统。               

RT-PCR操作步骤RNA抽提

方法：TRlzol法。

主要成分：phenol（具有裂解细胞和变性蛋白的作用）。

RNA抽提前准备：试剂耗材准备（注意RNase free）、样品的准备。

操作步骤：样品+1ml TRlzol室温裂解10min+200μLTrichloromethane振荡30s后室温静置2-3 min；4℃低温离心（12 000g×20min）；400μL上层水相+600μL异丙醇室温沉淀10min；4℃低温离心（12 000g×20min）；75%乙醇冲洗；晾干沉淀，DEPC-treated水溶解。

RNA 质量检测

方法：分光光度计测定、凝胶电泳法

反转录

是以RNA为模板合成cDNA的过程。在这个过程中遗传信息的流动方向和转录时相反，所以称为“反转录”。在这个过程中需要一个反转录酶，合成的DNA称为与RNA互补的DNA（complementary DNA, cDNA）。这个过程中根据不同的情况选择不同的反转录引物，如果要检测的RNA有poly A尾巴，可以用Oligo(dT)做反转录引物；如果要检测的RNA没有poly A尾巴，就用随机引物（random primer）来反转；如果要检测的RNA序列已知，可用特定引物（specific primer）来反转。

PCR程序

三步法：

第一步：94℃变性30s；

第二步（循环30-35次）：94℃变性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸24s（时间按照合成速度和长度来计算）；

第三步：72℃终止延伸5-10min。

 

引物

引物设计步骤：

找到目的基因的CDs序列（存在多个转录本时可对各个转录本的保守区域进行引物设计）；用软件设计和评价引物（Oligo软件）；blast引物特异性。

 

要求：

引物长度为15-30bp，最常用的为23bp；引物Tm值介于62-73℃之间，上下游引物Tm最好相近以保证其能高效工作；3’-端的Tm值要低于5’端；引物GC含量约为40-60%；避免扩增模板的二级结构域；避免引物的二级结构；避免与靶DNA错配。

 

 PCR酶

可按需要选择普通的Taq酶、可扩增长片段的Taq酶或高保真酶。

 

 PCR体系

按所选的PCR酶说明书来配制。

 

PCR产物检测

一般采用琼脂糖凝胶电泳，必要时也可使用Poly(acrylamide)凝胶电泳。

影响逆转录PCR的重要因素不同的mRNA转录成cDNA的效率不同，适合某一种mRNA转录的条件可能对另一种mRNA不适合，因此，在进行不均一mRNA反转录时，下面的参数非常重要。

一、逆转录酶

二、合成 cDNA的引物

三、缓冲液及dNTPs

如何提高RT-PCR的特异性一、引物选择

cDNA第一链合成的起始可以使用三种不同的方法：随机引物法、oligo（dT）引物法和基因特异性引物法。各种方法的相对特异性影响了合成的cDNA的量和种类,特异性低的引物，合成的cDNA的量会比较大，种类也比较杂。

 

随机引物法

随机引物是碱基序列具有随机性的寡核苷酸，其长度通常为6个核苷酸，能够与样品中所有类型的RNA结合。当特定的mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝全长序列时，可采用随机引物来拷贝全长mRNA。随机引物法是三种方法中特异性最低的。使用此方法时，体系中所有的RNA分子都充当了合成cDNA第一链的模板，合成的cDNA中96%来源于rRNA。

 

 Oligo(dT)法

Oligo（dT）引物由12-18个脱氧胸腺核苷酸组成，能够与真核mRNA的Poly(A)尾部相结合。这种引物适用于以真核mRNA为模板构建cDNA文库、全长cDNA克隆，不适用于以降解的RNA为模板进行逆转录。由于Poly(A) RNA仅占总RNA 的1-5%， 故这种引物合成的cDNA比随机引物法得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。这种方法比随机引物的特异性高。

 

特异性引物法

特异性引物法是特异性最高的一种方法，该方法中的引物含有与目标RNA序列互补的寡核苷酸，用此类引物仅合成所需的cDNA。

二、提高逆转录保温温度

较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使两者可以结合。然而，某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。较高的保温温度可以提高特异性，尤其在使用基因特异性引物进行cDNA合成时。

三、使用具有较高热稳定性的逆转录酶

热稳定逆转录酶可以在较高温度下保温，以提高cDNA合成的特异性。举个栗子，如果一个基因特异性引物（GSP）的退火温度为55℃，那么使用AMV或M-MLV在37℃进行逆转录，GSP所带有的特异性就没有完全利用。然而， 某些具有强热稳定性的逆转录酶可以在50℃或者更高的温度下进行反应，这就会消除较低温度时产生的非特异性产物。