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蛋白质组学相关问题与解答

人阅读 发布时间:2021-01-05 19:56

1.为什么通过elisa、WB能检测到的蛋白在itraq实验中没有检测到?

     人血浆中的蛋白是有上万种的,而一般质谱只能检测到五六百种,也就是说只占了其中的百分之几,这是普遍现象,说明咱们的方法是不存在问题的;其次,ELISA/WB与质谱相对来说灵敏度不一样,前者具有放大效应,因为其间会用到相应的抗体,所以只要选对抗体,感兴趣的蛋白基本都会被检测到;因此, ELISA/WB检测到的蛋白在组学中没有被检测到也是正常的。

 

2.itraq的结果,用elisa验证了两个差异蛋白,发现都是阴性结果,是什么情况,出现阴性的概率有多大?一般我们会提到这个概率吗?

     iTRAQ结果中,选择的蛋白是否得分够高,变化倍数大不大,选择的抗体特异性是否好,都可能会影响WB和iTRAQ的结果,如果以上三方面没有什么问题的话,基本上80%还是方向一致的。

 

3.iTRAQ、TMT、Labe lfree实验用的是什么质谱仪,其定量是基于一级质谱还是二级质谱?

      基于LC-MSMS的实验技术主要使用的是ABI5600-Triple-TOF,同时公司也具有Thermo Q-Exactive质谱仪平台,部分实验项目使用的是QE-Exactive完成。其中标记定量技术iTRAQ和TMT是依据二级质谱的报告基团离子峰进行定量,而Labe lfree是基于一级质谱峰进行定量。

 

4.蛋白组学实验文章一般发表在哪些期刊上,各有什么区别?

MCP(molecular & cellular proteomics(影响因子7分左右)

JPR(journal of proteome research(影响因子5分左右)

Proteomics(影响因子4分左右)

Journal of Prteomics(影响因子4分左右),

Electrophoresis(影响因子4分左右),

Plos One(影响因子3分左右),

其它的杂志还包括BMC Genomics, Expert Rev Proteomics, BMC Syst Biol, OMICS, Proteomics Clin Appl, Proteome Sci

 

5.有两个Mix混样,在计算差异表达蛋白时如何使用?

     计算差异表达蛋白时,将WT组(113、114、115)与Mix1(119)和Mix2(121)的比值取平均值,APO1组(116、117、118)与Mix1(119)和Mix2(121)的比值取平均值,平均值再进行差异筛选。

 

6.生物学重复和技术重复的区别?

      生物学重复是指不同生物个体或者不同生物群体的样品之间进行地相同处理而进行的实验,而技术重复是指同一样品进行的多次相同实验。举例:对来自三只健康小鼠A、B、C的血清样品分别各进行一次双向电泳,这三次双向电泳就是生物学重复;而取其中一只小鼠的血清样品进行三次双向电泳,或者将三只小鼠的血清混合后的样品进行三次双向电泳,这三次实验就是技术重复。总结生物学重复的样品来自不同的个体或者是群体,重复之间样品不同;而技术重复的几次实验的样品完全相同,可以来自单一个体,也可以是多个个体的混合样品,但用于重复实验的样品完全一样。

 

7.结果报告中怎么没有差异多肽的定量?

      多肽组质谱数据进行搜库匹配后的结果会进行归一化整理并寻找差异多肽,所以说差异多肽的定量结果是有的,且以Excel发给客户,报告中一般会提及差异多肽的个数,具体的定量信息如果客户有需求也是可以添加的。
 

8.哪些技术需要进行重复实验,以及具体采用生物学重复还是技术重复来完成?

      Label free需要进行三次重复,而iTRAQ、TMT一般建议客户做3次实验重复,如果实验方案后期设计了大量的验证实验如WB或ELISA等,最好做也能做两次重复;如果不进行重复实验后期的验证实验也少,在后期发表文章的时候结果可能会受到一些审稿人的质疑,从而影响文章的发表,特别是一些高分杂志较为突出,对于立志于发表高水平文章的研究人员建议客户最好进行重复实验设计。如果是进行技术重复,各实验结果之间的数据重复性会更好,而生物学重复由于多种原因可能导致重复性与偏差或者不好,一般情况下Label free最好使用技术重复,这样有利于后续数据的分析,而其他是实验可以采用生物学重复或者技术重复。代谢组根据样品的不同选择合适的数量进行生物学重复。

 

9.如何来判定哪些蛋白是和自己研究相关的蛋白,挑选什么样的蛋白来进行后期的验证实验?

     需要研究人员根据自己研究的相关生物学背景,再结合生物信息学分析的结果,以及查看相关的文献资料来确认哪些蛋白可以用于后续深入的研究。

 

10.样品寄送过程,哪些需要低温?哪些需要干冰?哪些常温就可以?

      细胞、组织、蛋白溶液、菌体等样品最好采用干冰运输,对于SDS-PAGE条带和2D点以及酶解好的肽段样品直接常温运输即可。可以理解为需要提取蛋白或提取好的蛋白样品(易降解)都需要低温运输,而处于凝胶中的蛋白或者是酶解好的肽段可常温运输。

 

11.哪些样品需要去除高丰度蛋白?怎么去除?

(1)一般情况下,血清、血浆样品中都会存在高丰度蛋白(白蛋白等免疫蛋白),如果客户是此类样品,需提前跟客户沟通好,一定需要去除高丰度蛋白;目前有成熟的试剂盒可以去除血清中的高丰度蛋白。

 

(2)体液样品,细胞培养液等样品,出现高丰度蛋白的情况也比较高,这类样品,如果出现高丰度蛋白,需要先通过质谱鉴定是否是常见免疫蛋白,然后再采用高丰度蛋白去除试剂盒进行去除。

 

(3)其他样品存在高丰度的情况不常见,如在实验过程中发现高丰度蛋白,解决方案如上。其他样品可能会出现鉴定出来的高丰度蛋白没有合适的试剂盒可以去除,这时候需要跟客户提前告知风险。

 

12.蛋白质组结果一般需要做哪些方面的生物信息学分析?

       目前一般文献中的分析主要为维恩图分析、热图分析、火山图分析、层次聚类分析、蛋白质功能分析(GO分类为主)、蛋白质所属代谢通路富集分析(基于KEGG的pathway)、差异蛋白互作网络构建、转录因子预测等方面。

 

       其它一些比较特异的高级分析包括多组数据关联分析、多pathway延伸分析、磷酸蛋白激酶预测分析、互作网络及生物调控模型构建分析。

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