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公司新闻/正文

抗体常见问题WB及IHC

人阅读 发布时间:2021-01-05 19:28

问题 原因 解决方案
条带形状不好看 胶凝的不均匀,聚合不好 灌胶前将溶液充分混匀
上样齿扭曲使上样孔大小不一 上样前用针头将齿拨正,注意不要将针头插入胶内
某些样品盐浓度较高 除盐或将样品盐浓度调成一致
每孔上样量不一致 调整上样量使基本一致
缓冲液陈旧,成分改变 重配
凝胶下面有气泡 电泳前先将气泡赶走
电泳时温度过高 降低电流或电压
目的蛋白信号弱 样品上样量不足或目的蛋白浓度过低 加大上样量或浓缩样品
转膜效率低 以下单列
抗体浓度低 增加抗体浓度或延长孵育时间
显色剂底物浓度不足 增加显色剂用量
显色剂失效 更换显色剂(吸取A、B液的枪头不可混用)
显色或曝光时间不足 延长显色或曝光时间
转膜效率低 转膜缓冲液pH值与目的蛋白等电点相近 提高转膜缓冲液pH值
凝胶与膜之间存在气泡 转膜前要排尽气泡
凝胶与转印膜两侧滤纸大面积接触 滤纸、转印膜和凝胶大小要基本一致,避免滤纸直接接触
转印膜种类选择不当 使用质量可靠的PVDF膜或硝酸纤维素膜
电压或电流过小 湿转时20mA恒流,半干转时25V左右恒压
转印时间过长或过短,蛋白还在凝胶中或穿透转印膜 先电泳,根据蛋白大小及转印装置选择合适的转印时间
湿转过程中环境温度过高 使用预冷的转膜缓冲液或将装置至于4度
显色或曝光后无条带 胶与膜方向反了 转膜时应依次放好PDVF膜与凝胶所对应的电极,即凝胶对应负极,PDVF膜对应正极。
选用的一抗、二抗及显色方法不合适 选择合适的一抗、二抗和显色方法
目的蛋白含量低于检测下限 加大上样量或浓缩样品
抗体效价过低 增加抗体浓度
抗体孵育时间不足 延长孵育时间,37°C孵育1小时以上
抗体过度洗涤 减少洗涤时间及次数
加入HRP底物反应与曝光检测之间间隔时间过长 反应3到5分钟及时检测
背景过高 封闭物用量不足 提高封闭物浓度,孵育时保证封闭液完全浸没转印膜
封闭物使用不当 检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭
封闭时间不够 室温37度封闭1小时以上,4度封闭过夜
抗体非特异性结合 降低抗体浓度,减少孵育时间
抗体浓度过高或洗涤不够 降低抗体浓度,增加洗涤次数和时间
化学显色底物过多 按说明书加入适量的显色底物
杂带多 杂蛋白多 处理目的蛋白
抗体特异性不强 使用特异性强的抗体
抗体孵育时间过久 减少抗体孵育时间
二抗与抗原有交叉反应 选择合适的封闭物
底物显色与曝光时间长了 缩短显色及曝光的时间
大分子量WB 膜孔径太小 更换孔径较大的膜
转膜电压电流低 提高电压/电流
转膜时间短 延长转膜时间
胶浓度太大 使用低浓度的胶
转膜缓冲液配方不合适 调整转膜缓冲液中甲醇及SDS浓度
 
问题 原因 解决方案
边缘效应 组织边缘贴附不牢,边缘组织松脱漂浮于液体中 APES/多聚赖氨酸处理玻片;组织切片尽量薄;尽量避免选用坏死较多的组织
试剂未充分覆盖组织 滴加试剂时让试剂完全覆盖组织
非特异性染色体 抗体质量问题 使用质量有保证的抗体
抗体孵育时间长 减少孵育时间
抗体浓度过高 降低抗体浓度
一抗为多抗 使用单克隆抗体
内源性过氧化物酶及生物素 延长灭活时间
封闭不足 延长封闭时间
DAB孵育时间过久或浓度过高 按说明书配置试剂,镜下控制反应时间
抗体孵育后洗涤不充分 每次孵育之后洗3*5次
滴加试剂时干片 及时滴加试剂
切片在缓冲液中浸泡过久 抗原修复之后及时封闭加一抗,不能过夜
阴性结果 抗体浓度及质量 选择有质量保证的抗体,先做预实验摸索抗体使用浓度
抗原修复不全 摸索合适的抗原修复方式及修复时间
抗原丰度 正常阴性
封闭时间过长 减少封闭时间
DAB孵育时间短 镜下控制显色时间
细胞通透不全,抗体未能进入细胞反应 选择合适的通透剂及其反应时间
一抗二抗不匹配 选择正确来源的二抗
脱片 玻片未处理好 玻片清洗干净后用APES或多聚赖氨酸处理
切片厚薄不均匀 更换刀片;调整好切片机状态
烤片时间或温度不够 60摄食度2小时
组织自身问题 肿瘤坏死组织及骨组织本身易脱片
抗原修复时温度迅速变化 抗原修复后让其自然冷却
操作时用力过猛 有脱片嫌疑的切片不要用力甩,用吸水纸吸干残余液体
染色弱 抗体浓度低,孵育时间短 提高抗体浓度,延长反应时间
试剂使用超过有效期 试剂定时更新
滴加试剂时残余缓冲液过多使试剂稀释 滴加试剂前尽量减少残余液体
封闭过度 减少封闭时间
着色不均匀 切片厚度不一致 更换刀片;调整好切片机状态
试剂配制未混匀使局部浓度不一致 试剂充分混匀后滴加
试剂未完全覆盖组织 滴加试剂时让试剂完全覆盖组织
脱蜡不完全 更换脱蜡剂或延长脱蜡时间

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